De tuin werd opgericht in 1544 onder Cosimo I de' Medici als de eerste aan een universiteit gelieerde botanische tuin ter wereld. De leiding werd toevertrouwd aan de bekende botanicus Luca Ghini. In 1563 werd de tuin verhuisd van zijn oorspronkelijke locatie aan de oever van de Arno (nu het arsenaal van De Medici) naar een locatie in de buurt van het Convent van Santa Marta. In 1591 verhuisde de tuin naar zijn huidige locatie. Uit de vroege tijden heeft de tuin een aantal zaken overgehouden, waaronder een galerij van natuurlijke objecten (nu het natuurhistorisch museum), een bibliotheek (nu onderdeel van de universiteitsbibliotheek) en portretten van zijn vroegere directeuren. Ook heeft de tuin een van de oudste broeikassen met een ijzeren frame in Italië.
De tuin is verdeeld in afdelingen met de botanische school, tuinen, vijvers, kassen en meerdere gebouwen. Bekende bezienswaardigheden zijn kruidentuinen, arboreta en het oude botanische instituut dat werd gebouwd tussen 1591 en 1595 en een gevel versierd met schelpen heeft.
De tuin is op werkdagen 's ochtends geopend en voor een klein bedrag te bezoeken.
